卡梅德生物技术快报｜BMP2-ColG 融合蛋白纯化方案

在原核重组蛋白实验开发中融合蛋白纯化是包涵体蛋白研发的核心技术难点尤其对于 BMP2 这类富含二硫键、易聚集的蛋白传统融合蛋白纯化方案存在复性效率低、流程复杂、活性损失大等问题。本文基于卡梅德生物技术快报提供一套参数标准化、步骤可复现、以纯化为核心的 BMP2-ColG融合蛋白纯化实验方案适用于生物实验室研发、蛋白工艺开发。一、方案背景BMP2 是调控骨组织发育的关键因子大肠杆菌表达是其工业化生产的首选体系但该蛋白极易形成包涵体常规融合蛋白纯化工艺难以兼顾产量与活性。本方案采用 His-SUMO 双标签辅助结合冻融法溶解、Ni-NTA 亲和层析、柱上原位酶切完成高效融合蛋白纯化表达量提升 2.04 倍回收率达 25%可直接用于下游功能实验。二、实验材料菌株与质粒E. coli BL21 (DE3)、pET22b-His-SUMO-BMP2-ColG主要试剂Ni-NTA Bead 6FF、咪唑、尿素、SUMO 蛋白酶、PB/Tris-HCl 缓冲液仪器设备高速冷冻离心机、超声破碎仪、层析系统、SDS-PAGE 电泳装置三、核心融合蛋白纯化流程1. 包涵体制备融合蛋白纯化原料获取种子液接种至含氨苄青霉素 LB 培养基37℃、200 r/min 过夜培养转接发酵OD6000.6 时加入 0.25 mmol/L IPTG30℃诱导 12 h50 mL 菌液 4℃、12000 r/min 离心 2 min弃上清25 mmol/L Tris-HClpH7.5重悬菌体冰水浴超声破碎离心收集沉淀即为融合蛋白纯化所需包涵体。2. 包涵体洗涤提升融合蛋白纯化纯度洗涤液20 mmol/L PB1 mol/L Urea1% Triton X-100pH8.0洗涤液重悬包涵体充分涡旋混匀4℃、12000 r/min 离心 15 min弃上清重复洗涤 2 次获得纯净包涵体降低融合蛋白纯化杂蛋白干扰。3. 冻融法溶解优化融合蛋白纯化复性效率溶解液20 mmol/L PB2 mol/L UreapH8.0包涵体重悬于溶解液-20℃冷冻 12 h室温解冻解冻液 4℃离心 15 min收集上清进入融合蛋白纯化核心步骤。4. Ni-NTA 亲和层析融合蛋白纯化关键步骤平衡液 A20 mmol/L PB8 M UreapH8.0洗脱液 B20 mmol/L PB8 M Urea150 mmol/L NaCl300 mmol/L 咪唑pH8.05 倍柱体积平衡液 A 平衡 Ni-NTA 柱冻融上清上样室温孵育 2 h使蛋白结合柱料平衡液 A 淋洗至 UV280 平稳去除未结合蛋白梯度咪唑淋洗100% 洗脱液 B 收集目的蛋白完成初级融合蛋白纯化。5. 柱上原位酶切融合蛋白纯化终步去标签层析柱重新平衡融合蛋白与 SUMO 蛋白酶混合上柱室温孵育 2 h收集流穿液获得无标签 BMP2-ColG 纯品完成全套融合蛋白纯化。四、融合蛋白纯化质量检测SDS-PAGE检测融合蛋白纯化后蛋白分子量与纯度Western Blot验证 His 标签与 SUMO 标签去除效果ELISA检测胶原结合活性确认融合蛋白纯化后功能保留细胞实验检测成骨标志物表达验证蛋白生物活性。五、融合蛋白纯化技术要点His-SUMO 双标签同时提升表达量与融合蛋白纯化便利性冻融法替代传统复性大幅提升融合蛋白纯化效率与活性回收率柱上酶切简化融合蛋白纯化流程减少蛋白损失降低实验成本。六、方案总结本方案是一套标准化、可复现的融合蛋白纯化流程针对 BMP2 类包涵体蛋白优化从包涵体制备到无标签纯品获取全程聚焦融合蛋白纯化核心环节操作简便、稳定性强适合生物实验室、研发企业用于重组蛋白融合蛋白纯化工艺开发为同类融合蛋白纯化提供通用技术模板。参考文献刘清平杨林欣王珊瑛等。融合蛋白 BMP2-ColG 在大肠杆菌中的表达及纯化 [J/OL]. 中国生物工程杂志2026.